Western blot實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)

一.實(shí)驗(yàn)步驟

1. 組織塊稱重

2. 利用液氮、研缽粉碎組織塊

3. 加入RIPA緩沖液(每克組織3 ml RIPA)，PMSF(每克組織30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron進(jìn)一步勻漿(15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘)維持4℃

4. 加入PMSF(每克組織30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分鐘

5. 移入離心管4℃ 約20,000 g(約15,000轉(zhuǎn))15分鐘

6. 上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存

7. 進(jìn)行Bradford比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度

8. 取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液(體積*蛋白質(zhì)濃度)，并加等體積的2×電泳加樣緩沖液

9. 沸水浴中3分鐘

10. 上樣

11. 電泳(濃縮膠20mA，分離膠35mA)

12. 電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜(100mA 40分鐘)

13. 膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍(lán)染色

14. Westernblot 試劑盒顯色

15. 分析比較記錄

western blot的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)的資料

1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。

1)轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來(lái)回滾動(dòng)去除所有的氣泡。

2)在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙(預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕)，將凝膠夾在中間，保持濕潤(rùn)和沒(méi)有氣泡。

3)將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。

4)將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒(méi)凝膠。

5)按照廠家所示接通電源開(kāi)始電泳轉(zhuǎn)移。

6)轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。

2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。

3. 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時(shí)可用脫色緩沖液。

4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí)。

5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。

6. 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。

7.袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。

8.混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體(10毫升)，加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí)(或4℃過(guò)夜)

9.用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。

10. 將連接*的羊抗兔IgG(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS)加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。

11.按步驟9洗滌。

12.加入抗生素(antibiotic)蛋白-HRP(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS)，于室溫下?lián)u動(dòng)。

注意事項(xiàng)：

western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識(shí)別空間表位的抗體不能用于western blot檢測(cè)。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白物素化，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行western blot。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。

Western可以參考如下步驟進(jìn)行操作。

1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)

可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖海绫淘铺焐a(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提，例如碧云天生產(chǎn)的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒。收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用碧云天生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液，可以使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。

2. 電泳(Electrophoresis)

(1) SDS-PAGE凝膠配制

SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。

(2) 樣品處理

在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)。

100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白.

(3) 上樣與電泳

冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。

電泳時(shí)通常推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對(duì)于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求，也可以采用碧云天的多功能電泳儀(帶定時(shí))。為了電泳方便起見(jiàn)，也可以采用整個(gè)SDS-PAGE過(guò)程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定定時(shí)時(shí)間為90-120分鐘。設(shè)置定時(shí)可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過(guò)頭。通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。

3. 轉(zhuǎn)膜(Transfer)

我們推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過(guò)程中特別是用鑷子夾取等過(guò)程中容易裂開(kāi)。膜的使用請(qǐng)參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。

通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過(guò)夜。轉(zhuǎn)膜時(shí)也可以使用碧云天的多功能電泳儀(帶定時(shí))。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。

在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量zui大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。

4. 封閉(Blocking)

轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。

用微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60分鐘。對(duì)于一些背景較高的抗體，可以在4℃ 封閉過(guò)夜。在整個(gè)Western過(guò)程中我們推薦使用碧云天生產(chǎn)的側(cè)擺搖床，側(cè)向擺動(dòng)速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)

參考一抗的說(shuō)明書，按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗。

用微型臺(tái)式真空泵吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以在4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜。

回收一抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

參考二抗的說(shuō)明書，按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。用微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。

回收二抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

7. 蛋白檢測(cè)(Detection of proteins)

參考相關(guān)說(shuō)明書，使用BeyoECL, Western 熒光檢測(cè)試劑等ECL類試劑來(lái)檢測(cè)蛋白。

洗片時(shí)可以使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒(méi)有自動(dòng)洗片機(jī)，可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。

8. 膜的重復(fù)利用(Membrane recovery)

如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液處理蛋白膜，以重復(fù)利用蛋白膜。